Kuo skiriasi įprastinė PGR sistema nuo realiojo laiko PGR sistemos?


Atsakymas 1:

Trumpai tariant, principas yra tas pats: jūs turite du pradmenis (FW ir RV). Jie yra sukurti atsižvelgiant į konkretų taikinį arba skirti surišti su keliais taikiniais, tačiau jie turi bendrą konservatyvią seką.

Dabar realiojo laiko PGR metu pradmenų panaudojimas yra derinamas su fluorescenciniais dažais, kurie suriša per dvigubos grandinės DNR (dar žinomus kaip tarpdančių junginiai, pvz., SYBR Green) arba su zondais, nešiojančiais fluorochromą ir gesintuvą. Abu metodai (jei jums reikia juos išsamiai žinoti, aš jums paaiškinsiu, bet čia prilipsiu prie pagrindinio klausimo) leidžia realiu laiku stebėti tikslinės DNR molekulės amplifikaciją amplifikacijos metu, pateikiant tyrėjui kiekybinė analizė.

Kodėl tai naudinga?

Ką daro PGR? Tai sustiprina. Kiekvienas amplifikacijos įvykis vadinamas amplifikacijos ciklu. Paprastai amplifikacijos apskritimai palaikomi žemiau 30 dalelių kiekvienoje reakcijoje (tarp 25 ir 28). Kodėl tai? Nes PGR naudojamas norint pamatyti, ar kažkas yra, ar nėra, ar kažkas yra tokios būklės, daugiau ar mažiau, palyginti su kontroline. Jei stiprinimo žingsnių yra per daug, jūs negalėsite suprasti, ar kažkas tikrai yra, ar matote signalą vien todėl, kad leidote tam tiek laiko sustiprėti, kad galų gale atrodo, kad ten kažkas yra nesakykite „kiekybiškai įvertinti“, nes standartinis PGR daro tai neįmanoma dėl savo prigimties).

Pavyzdžiui, A buvo mažesnis nei B. Amplifikacija prasideda ir po 30 ciklo paleidžiate gelį, ir A, ir B turi stiprų signalą. Taigi jūs sakote „A = B, nėra skirtumo tarp kontrolės ir eksperimento“. Tai nebūtų atsitikę, jei, pavyzdžiui, būtumėte padarę tik 25 ciklus, matote, ką turiu galvoje?

Nors ir PGR realiu laiku, galite pamatyti ciklą, kiek amplifono (amplifikuotos grandinės) tuo metu buvo to konkretaus ciklo metu. Taigi, jei jūs vykdote 30 ciklų, kai gausite rezultatą, pažiūrėję į ankstesnį stiprinimo ciklą, galite pasakyti „gerai, kad skirtumas yra tikras“ arba „nėra skirtumo“.

Tai iš tikrųjų yra programinės įrangos darbai. Jūs turite slenkstį (taigi pamatysite signalą, tik jei jis viršija tam tikrą kiekį, jį gali nustatyti scitistas, remdamasis savo paties poreikio patirtimi). Ir kaip matote, virš 30 ciklo figūra pradeda plato. Tada nebus įmanoma atskirti daiktų, nes jie atrodys vienodai! Tačiau programinė įranga leidžia jums peržvelgti visus ciklus ir apžvelgti, kas nutiko po ciklo.

Tikiuosi, kad prireiks daugiau informacijos ar paaiškinimų, tiesiog praneškite man.


Atsakymas 2:

Jūs neklausėte, bet aš pabrėžsiu, kad yra dar viena populiarėjanti kiekybinė PGR schema: skaitmeninė PGR.

Realaus laiko PGR neigiama pusė yra ta, kad negalite gauti tikrai kiekybinių rezultatų nereaguodami į standartus. Viena pagrindinių to priežasčių yra ta, kad skirtingi amplikonai turės skirtingą amplifikacijos efektyvumą, o tam savo ruožtu gali turėti įtakos skirtingos reakcijos sąlygos (pvz., Nevienoda temperatūros kontrolė PGR plokštelėje) arba mėginio teršalai. Skaitmeninis PGR pašalina šias problemas, paversdamas PGR dvejetainine sistema: arba amplifikacija matoma, arba nematyta.

Skaitmeninę PGR sudaro daugelio PGR reakcijų vykdymas lygiagrečiai, naudojant tą pačią įvesties medžiagą. Apgaulė yra ta, kad mėginys praskiedžiamas taip, kad tikimasi, kad daugelyje reakcijos kamerų nebus šabloninių molekulių. Atliekama PGR, tada suskaičiuojamas teigiamų kamerų skaičius. Pridedant tai į lygtis, pagrįstas Puasono pasiskirstymu, gaunamas įvestų molekulių skaičius. Kadangi skaičiavimas pagrįstas skaičiumi, skaičius nepriklauso nuo standartinės kreivės; tai tiesmukai kiekybiškai.

Buvo parduota daugybė skaitmeninių PGR sistemų, naudojančių šulinius ar lašelius reakcijos kameroms. Jie taip pat skiriasi PGR kamerų skaičiumi; lašelių schemos paveikė daug, daug daugiau. Tikslumas ir dinaminis diapazonas yra susieti su lašelių skaičiumi - turėdami daugiau kamerų, galite būti toliau nuo savo pradinės koncentracijos spėlionės.

Skirtingos schemos siūlo skirtingas įrangos sąnaudas ir darbo eigos lengvumą. Pavyzdžiui, „Fluidigm“ prietaisas yra visiškai integruotas, bet siūloma, manau, mažiau nei 1000 kamerų viename mėginyje, tuo tarpu „BioRad“ sistema turi atskiras emulsinimo, amplifikacijos ir skaičiavimo stadijas (su dviem tam skirtais įtaisais; termociklinimas vyksta standartiniame termocikleryje) ir dešimtys tūkstančių kamerų.